近期，中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室（LMB）/广东省海洋药物重点实验室（LMM）闫岩研究员团队完成了对真菌来源的quadrane新骨架倍半萜terrecyclic acid的生物合成研究，成果发表在英国皇家化学会旗舰期刊《Chemical Science》上，文章被该刊评为每周亮点论文和2024热点论文。

倍半萜是萜类化合物中占比最多的一种，分子中含15个碳原子，由三个异戊二烯单元组成链状、环状等多种骨架结构，分布于植物、昆虫、微生物等生物中，具有广泛的生物活性，是医药、食品和化妆品研发的重要源泉。Terrecyclic acid是一类由环戊烷骈双环辛烷组合而成的quadrane倍半萜骨架，经过氧化后修饰而成的一类具有抗菌、抗肿瘤活性天然产物。该类化合物最早发现于土曲霉，后又相继从不同来源的真菌和柳珊瑚中发现（如图1）。

图1 来自真菌（A）和柳珊瑚（B）的天然quadrane倍半萜

由于quadrane骨架的特殊结构与良好的生物学活性，其制备方法的研究受到广泛关注，其中合成化学家先后开发出20余条合成路线。然而由于该类化合物特殊的结构和成环方式，使得其化学合成步骤多，产率较低，在一定程度阻碍了先导药物的开发。通过合成生物学方法大量制备quadrane类天然产物，是解决这一问题的有效策略。同位素示踪实验表明，quadrane骨架的生物合成可能经历了两种完全不同的途径，即Hirota途径和Coates途径。尽管计算化学研究表明后者的可能性更高，但quadrane骨架的生物合成基因与其形成的确切酶学机制仍有待证实（路径图1）。

路径图1 推测的 β-terrecyclene形成途径. (A) Hirota途径 (蓝色)和Coates分别由FPP生成的β-terrecyclene。(B) Coates重排形成的 α-terrecyclene。

闫岩研究员团队通过对真菌基因组的挖掘，发现了该类化合物的生物合成基因簇ter，包括一个萜类环化酶（terpene cyclase，TC）即terA、一个P450氧化基因（terB）、一个短链脱氢基因（terC）和一个主要协同转运因子超家族基因（terD），如图2A。通过异源表达、体内喂养、体外酶反应等研究，验证了基因簇中各基因的功能（图2B-2E），证实了其生物合成途径：即在环化酶TerA的作用下催化FPP产生化合物25，进而产物25被P450酶TerB羟化和羧基化产生化合物32，最后32被脱氢酶TerC催化形成终产物2，如图2F。

图2 抗肿瘤倍半萜terrecyclic acid的生物合成途径解析 （A）Terrecyclic acid的生物合成基因簇；（B）蛋白TerA在酵母S. cerevisae中的异源表达（i）和体外反应（ii）；（C）基因簇ter在A. nidulans中的异源表达：（i）A. nidulans的空白对照，（ii）基因terAB在A. nidulans中的异源表达，ii）基因terABC在A. nidulans中的异源表达；（D）蛋白TerC的体外反应：（i）蛋白TerC将底物32转化为2，（ii）煮沸过的TerC对底物32失活，（iii）蛋白TerC对底物33无反应；（E）蛋白TerB的体外反应：（i）微粒体蛋白TerB可以催化底物25转化为32，（ii）蛋白TerB和TerC可以将25转化为2；（F）Terrecyclic acid (2)的生物合成途径。

在发现新型倍半萜环化酶（β-terrecyclene合酶，TerA）可以催化法尼基焦磷酸（FPP）转化为β-terrecyclene（25）的基础上，通过对TerA的系列定点突变研究（图3），结合动力学同位素效应分析（图4），确证了环化过程为Coates途径，而非最早提出的Hirota途径。

图3 基因terA的点突变、产物及其机制

图4 突变株TerA-V114A的动力学同位素效应 (A) 通过 [12-2H3]-FPP 的动力学同位素效应区分Hirota和Coates途径. (B) FPP和[12-2H3]-FPP 为底物比较TerA-V114A产物的动力学同位素效应。

通过以上研究，作者发现了抗菌、抗肿瘤quadrane骨架倍半萜terrecyclic acid的生物合成基因簇，以此为基础，解析了其通过β-terrecyclene环化酶TerA形成quadrane骨架，继而氧化、脱氢的后修饰的生物合成过程。Quadrane骨架的形成机制也通过对蛋白TerA的点突变和动力学同位素效应得以证实，从而解决了几十年来关于该类天然产物生物合成研究的谜团。该研究也为进一步以萜类环化酶TerA为探针，从真菌数据库中对quadrane类天然产物的发掘奠定了基础。

以上研究，副研究员宋永相为第一作者，研究员闫岩为通讯作者。由济南大学的王文贵博士，美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）唐奕（Yi Tang）教授团队合作完成。

上述研究工作得到了国家重点研发计划、海南省科技计划三亚崖州湾科技城科技创新联合项目、国家自然科学基金、中国科学院王宽诚率先人才计划“卢嘉锡国际团队项目”和海南省自然科学基金、广东特支计划 “海洋药物研究开发创新团队”等的资助。

Chemical Science作为英国皇家化学会资助的旗舰期刊，对各国研究人员在化学领域取得的突破性成果，经评审接收后免费发表，并对全球读者开放获取。文章接收后，被Chemical Science评为每周亮点论文（2024 ChemSci Pick of the Week Collection）和2024热点论文（2024 Chemical Science HOT Article Collection）。

本文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/sc/d4sc01208a。

文章相关信息：Yongxiang Song, Wengui Wang, Jiafan Yang, De-Wei Gao, John M Billingsley, Songtao Wang, Yiguang Zhu, Junfeng Wang, Jianhua Ju, Yan Yan* and Yi Tang. Chem. Sci., 2024, doi.org/10.1039/D4SC01208A